简述PCR技术操作步骤
原理:
DNA聚合酶链式反应技术简称PCR技术,是一种以模板DNA为基础,在引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下,利用DNA聚合酶的酶促反应,完成对模板的目的片段的快速扩增的过程。
步骤为:
(1)变性:双链DNA在94℃条件下,通过热变性使模板的双链DNA氢键断裂变成单链。
(2)复性:当变性温度突然降至引物Tm值(通常为35~65℃)以下时,会使引物与模板DNA互补序列杂交。由于引物一般由10~25个碱基序列,模板DNA结构远比引物分子复杂,且反应体系中引物分子的浓度又远大于模板DNA,故在退火温度时,引物与模板DNA容易结合形成互补链。
(3)延伸:在DNA聚合酶的作用下,以DNA为模板和以4种脱氧核糖核苷酸为原料,在Mg2+存在的条件下。DNA聚合酶依赖于其5'→3'的聚合酶活力,以引物结合于DNA模板链为起始点。使引物的序列得以延伸,合成模板DNA的互补链。
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